16年前的ThePlantCell要做到什么样的深度才能发表？作者巧妙、简单的实验设计，通过对蛋白的定位，验证了病原蛋白进入小麦叶肉细胞。
植物病原真菌(Pyrenophoratritici-repentis)分泌宿主选择性毒素(host-selectivetoxin,HSTs)作为致病因子。不像大多数的HSTs是酶途径的产物，至少有两种由P.tritici-repentis单基因控制产生的毒素是蛋白质，如ToxA。宿主对这些毒素的敏感性是由每种毒素的单个基因决定的。那么这些致病因子是怎么运作的呢？
1.ToxA在敏感型小麦中不被蛋白酶降解
作者开发了一种简单的方法来确定ToxA导入叶片的质外体后是否仍在细胞外;如果ToxA作用于细胞外，它应该可以被细胞外蛋白酶消化。因此，将敏感和非敏感小麦品种分别用异源表达的n端his-tagToxA(His-ToxA)处理2h，然后用蛋白酶K(PK)处理。随后对敏感叶片进行PK处理(ToxA/PK)会导致与不使用蛋白酶的ToxA处理相似的坏死(图1A)，表明细胞外ToxA暴露2h足以引起细胞死亡。如预期的那样，在ToxA处理过的不敏感叶片中没有检测到细胞死亡的症状(图1A)。PK单独处理对敏感或不敏感品种均无影响。
为了确定是否通过蛋白酶处理降解了ToxA，我们用镍珠从ToxA/pk处理的叶片的全细胞裂解液中提取了His-ToxA。使用抗ToxA抗体对镍珠洗脱物进行蛋白凝胶印迹分析，表明在PK处理后，敏感叶片的总裂解液中仍然存在完整的ToxA，但在不敏感叶片中几乎检测不到(图1B)。这表明，只有在敏感叶片中，ToxA才受到细胞外蛋白酶的保护。蛋白凝胶印迹检测到的His-ToxA大小与用于处理的ToxA大小相同;因此，ToxA似乎没有在植物中被加工。对内源的ToxA也得到了类似的结果。ToxA在敏感叶片中受保护不降解表明，它要么被内化，要么与被受体紧密的结合，以至于蛋白酶无法接近它。
图1ToxA敏感叶片对PK降解有保护作用。
2.ToxA蛋白免疫定位
为了确定ToxA是否内化在敏感细胞中，将敏感和不敏感的小麦用水或天然ToxA处理4小时，并制备薄片进行免疫定位。切片用抗ToxA抗体和Alexa标记的二抗进行染色，并用共聚焦显微镜观察叶绿体自身荧光(品红)和ToxA标记(绿色)。在水处理的不敏感区(图2A)或敏感区(图2B)或ToxA处理的不敏感区(图2C)中检测到的标记非常少。然而，在ToxA处理过的敏感小麦中广泛标记(图2D)，这说明ToxA存在于细胞质和质膜内部，偶尔以大量聚集的形式存在(图2D，实心箭头)。还发现ToxA与叶绿体有关(图2D，空心箭头)。叶肉细胞膜(图2A~2D)、表皮细胞膜(图2A、2B和2D)和维管组织(图2B和2C)中的绿色荧光是由于在处理和未处理的组织中可见的自身荧光，而不是由于ToxA处理。在ToxA处理过的敏感和不敏感小麦中，质膜完好无损(图2C和2D);因此，ToxA不会因为植物细胞膜对其内化而降解。另外两种不同的ToxA特异性抗体也观察到类似的定位模式。因此，在敏感小麦中，ToxA蛋白酶的保护是通过内化而不是受体结合造成的。
图2敏感小麦和不敏感小麦中ToxA的免疫定位。
3.ToxA融合绿色荧光蛋白处理敏感和不敏感小麦
作者运用了绿色荧光蛋白ToxA融合蛋白(GFP-ToxA)，进一步确定体内ToxA在细胞内积聚的位置。同时，实验结果也表明ToxA进入细胞时没有破坏细胞膜。ToxA进入细胞的机制足够强大，可以携带GFP融合标签。GFP-ToxA在敏感的叶肉细胞内持续数小时，然后细胞迅速死亡。ToxA刚进入阶段，由于细胞形态正常且未受干扰，细胞膜完整性和细胞结构似乎没有因ToxA进入敏感细胞而发生改变（图3）。
图3GFP-ToxA融合蛋白在敏感和不敏感小麦中的定位。
4.光激活ToxA
ToxA定位于叶绿体的研究表明，光诱导的叶绿体功能可能是ToxA活性的必要条件。为了验证这一点，作者用天然的ToxA或GFP-ToxA融合蛋白侵染敏感型小麦叶片，并在侵染区覆盖一个区域以遮挡光线。遮光几乎消除了ToxA诱导的组织塌陷和坏死，而在未覆盖的叶片区域，由ToxA和GFP-ToxA产生的坏死，说明该区域ToxA是活跃的。因此，ToxA和GFP-ToxA都需要光来诱导坏死（图4）。
图4ToxA活性依赖于光。
5.植物细胞表达ToxA导致细胞死亡
ToxA进入敏感植物细胞并不表明ToxA内化是其毒性的必需条件;细胞外ToxA引发的信号可能是细胞死亡的原因。如果ToxA的内化是必需的，并且足够诱导坏死，那么敏感的小麦细胞表达ToxA应该导致细胞死亡。基因枪技术已被用于证明一些由植物病原体产生的细胞死亡诱导蛋白有一个内部作用位点，利用ToxA(负信号序列)和β-葡萄糖醛酸酶(GUS)表达质粒共转化敏感和不敏感小麦品种。在本实验中，如果细胞因弓形虫的表达而死亡，则显示GUS活性的细胞将少于与GUS和对照质粒共转化的细胞。在敏感小麦和不敏感小麦中，ToxA与GUS共表达导致GUS表达细胞数量比对照减少50%，如果有内化作用位点这个数值则在预期范围内。敏感细胞和不敏感细胞对ToxA内部表达的结果类似表明，不仅ToxA内化是毒性反应的必要和充分条件，而且细胞内化ToxA的能力是区分敏感和不敏感的因素（图5）。
图5ToxA在敏感和不敏感的小麦品种中表达都导致细胞死亡。
总的来说，免疫定位和绿色荧光蛋白标记的ToxA定位表明，ToxA只在敏感小麦品种中内化。一旦被内化，ToxA就定位于细胞质室和叶绿体。ToxA通过基因枪在ToxA敏感细胞和ToxA不敏感细胞的细胞内表达导致细胞死亡，这表明ToxA在两种细胞中都存在作用位点。然而，由于ToxA只在敏感品种中内化，因此ToxA敏感性和ToxA敏感性基因很可能与蛋白质输入有关。同时研究结果表明，在没有病原菌的情况下，ToxA蛋白能够从植物质膜的质外体空间穿越到植物细胞内部。
原文链接：
转载请注明地址:http://www.1xbbk.net/jwbjj/3374.html
